ʻO ka pahu liʻiliʻi ʻili DNA
Hoʻohana kēia pahu i ka ʻōnaehana hoʻopaʻa maikaʻi a me ka ʻenehana hoʻomaʻemaʻe kolamu silica gel, hiki ke hoʻihoʻi i nā ʻāpana DNA 70 bp - 20 kb mai nā ʻano ʻokoʻa o TAE a i ʻole TBE agarose gel.Hiki i ke kolamu adsorption DNA ke hoʻopili kūikawā i ka DNA ma lalo o ke kūlana paʻakai kiʻekiʻe.Eia hou, hiki i ka pahu ke hoʻomaʻemaʻe pololei i nā ʻāpana DNA mai nā huahana PCR, nā ʻōnaehana hopena enzymatic a i ʻole nā huahana DNA crude i loaʻa ma nā ʻano hana ʻē aʻe, a wehe i nā haumia e like me nā proteins, nā mea hoʻohui ʻē aʻe, nā ion paʻakai inorganic a me nā kumu mua oligonucleotide.Hiki iā ia ke hōʻoia i ka hoʻomaʻemaʻe ʻana i loko o 10-15min.Hiki ke hoʻohana pololei ʻia ka DNA i hoʻomaʻemaʻe ʻia no ka ligation, ka hoʻololi ʻana, ka digestion enzyme, in vitro transcription, PCR, sequencing, microinjection, etc.
Nā kūlana mālama
E kūʻai ma -15 ~ -25 ℃ a lawe i ka lumi wela.
Nā ʻāpana
| Nā ʻāpana | (100 rxns) |
| Kākoʻo GDP | 80 ml |
| Hoʻopaʻa GW | 2 × 20 ml |
| Elution Buffer | 20 ml |
| ʻO nā kolamu liʻiliʻi ʻo FastPure DNA-G | 100 |
Kākoʻo GDP:Hoʻopaʻa paʻa DNA.
Mālama GW:holoi holoi;e hoʻohui i ka ethanol e ka leo i hōʻike ʻia ma ka ʻōmole ma mua o ka hoʻohana ʻana.
Elution Buffer:Elution.
Nā kolamu mini DNA maʻemaʻe-G:Nā kolamu adsorption DNA.
ʻO nā paipu hōʻiliʻili 2 ml:ʻO nā paipu hōʻiliʻili no ka kānana.
Nā mea i hoʻomākaukau ʻia
1.5 ml nā paipu sterilized, ethanol piha a me ka isopropanol (i ka ʻāpana DNA ≤100 bp, hoʻohui i 1 volume
isopropanol i 1 volume gel), ʻauʻau wai.
Kaʻina hoʻokolohua
E hoʻohui i 80 ml o ka ethanol e hoʻoheheʻe i ka Buffer GW e like me ka mea i hōʻike ʻia ma ka hōʻailona ma mua o ka hoʻohana ʻana, e mālama i ka lumi wela.
Mechanism
1. ʻO ka hopena hopena PCR
Hoʻolālā hoʻoheheʻe gel: E hoʻohui i ka nui like Buffer GDP PCR hoʻoponopono hoʻoponopono hoʻoponopono hoʻoponopono:E hoʻonui i 5 manawa i ka nui o ka Buffer
2. GDP E helu i ka nui o ka gel(100 μl like 100 mg)
E hoʻoheheʻe i ka gel
3. E wela mua ma 50 ~ 55℃
4. Nakinaki Holoi
Hoʻohui i 300 μL o Buffer GDP*
Hoʻohui i 700 μL o ka Buffer GW
Hoʻohui i 700 μL o ka Buffer GW
5. Elute
E hoʻohui i 20 - 30μL o ka Elution Buffer a i ʻole ka wai deionized
Nā memo* PCR hoʻihoʻi hou i ka wai me ka ʻole o kēia kaʻina
Papahana hoʻoheheʻe gel
1. Ma hope o ka DNA electrophoresis no ka hoʻokaʻawale ʻana i nā ʻāpana DNA, e ʻoki i ka ʻāpana DNA mai ka gel agarose ma lalo o ke kukui UV.Manaʻo ʻia e hoʻohana i ka pepa absorbent e hoʻopaʻa i ka makū o ka gel a hoʻemi i ka nui o ka ʻāpana gel ma ka wehe ʻana i nā agarose keu e like me ka hiki.E kaupaona i ka ʻāpana gel (me ka ʻole o ka paipu microcentrifuge) e helu i kona leo: ʻO ka nui o 100 mg gelslice ma kahi o 100 μL, me ka manaʻo ʻana he 1g/ml ka mānoanoa.
2. E hoʻohui i ka nui o ka Buffer GDP, e hoʻoulu i ka 50 ~ 55 ℃ no 7-10 min (e like me ka nui o ka gel, hoʻololi i ka manawa incubation a hiki i ka pau ʻana o ka gel).E hoʻohuli i ka paipu 2 manawa i ka wā o ka hoʻoulu ʻana.
ʻO ka hoʻohui ʻana o 1-3 mau puke o ka Buffer GDP ʻaʻole ia e hoʻololi i ka hana hoʻihoʻi DNA.Inā e hoʻihoʻi ʻia ka ʻāpana DNA <100 bp, pono e hoʻohui ʻia 3 mau puke o Buffer GDP;i ka pau ʻana o ka ʻāpana gel, e hoʻohui i 1 volume o ka isopropanol a hui pono, a laila e hoʻomau i ka pae aʻe.
3. Centrifuge pōkole e lawe i ka hāpana i lalo o ka paipu, e hoʻokomo i ka FastPure DNA Mini Columns-G i loko o ka Collection Tubes 2 ml, e hoʻololi pono i ka hopena maximally o 700 μL hoʻokahi manawa.
manawa i nā kolamu kānana, centrifuge ma 12,000 rpm (13,800 X g) no 30-60 sec.
4. E hoʻolei i ka kānana a hoʻohui i 300 μL o Buffer GDP i ke kolamu, e hoʻomoʻa i ka lumi wela no 1 min, centrifuge ma 12,000 rpm (13,800 X g) no 30-60 sec.
5. E hoʻolei i ka kānana a hoʻohui i 700 μL o Buffer GW (e nānā inā ua hoʻokomo mua ʻia ka ethanol piha!) i ke kolamu, centrifuge ma 12,000 rpm (13,800 X g) no 30-60 sec.
Δ E ʻoluʻolu e hoʻohui i ka Buffer GW a puni ka paia kolamu adsorption, a i ʻole e hoʻohui i ka Buffer GW i ka uhi hope a hui i luna i lalo no 2 - 3 mau manawa e kōkua i ka holoi ʻana i ka paʻakai e pili ana i ka paia o ka paipu.
6. E hana hou i ka hana 5.
ʻO Δ Flushing me Buffer GW ʻelua hiki ke hōʻoia i ka lawe ʻia ʻana o ka paʻakai a hoʻopau i ka hopena i nā hoʻokolohua ma hope.
7. E hoʻolei i ka kānana a e hoʻokahe i ke kolamu hakahaka ma 12,000 rpm (13,800 X g) no 2 min.
8. E hoʻokomo i ke kolamu i loko o ka 1.5 ml microcentrifuge paipu maʻemaʻe, e hoʻohui i 20 - 30 μL o Elution Buffer i ke kikowaena o ka membrane kolamu, e hoʻomoʻa no 2 min, a laila centrifuge ma 12,000 rpm (13,800 X g) no 1 min.E hoʻolei i ke kolamu, e mālama i ka DNA i loaʻa ma -20.
Δ Ka hoʻololi ʻana i ka supernatant o ka ʻanuʻu 8 i ke kolamu e hoʻoheheʻe hou a hoʻomaʻamaʻa mua i ka Elution Buffer i 55 (inā ʻāpana DNA>3 kb) hiki ke kōkua i ka hoʻonui ʻana i ka pono o ka hoʻihoʻi.
Papahana hoʻolaʻa huahana PCR
Hoʻohana ʻia kēia protocol e hoʻomaʻemaʻe i nā ʻāpana DNA mai nā huahana PCR, ka ʻōnaehana hopena enzymatic a me nā huahana crude DNA ʻē aʻe (me ka DNA genetic).Hiki i kēia hoʻonā ke hoʻopau pono i nā nucleotides, primers, primer dimers, paʻakai mole, enzymes a me nā mea haumia ʻē aʻe.
1. E hoʻopololei pōkole i nā huahana PCR, enzymatic reaction solution, a me nā huahana DNA ʻē aʻe.E hoʻohālikelike i ko lākou leo me ka pipette a hoʻololi i kahi paipu 1.5 ml a i ʻole 2 ml sterilized.E hoʻohui i ka ddH2O a hiki i ka leo i ka 100 μL;ʻoiai no ka DNA genomic me ka nui o ka nui, ʻo ka hoʻoheheʻe ʻana i ka 300 μL me ddH2O e kōkua i ka hoʻomaikaʻi ʻana i ka pono hoʻōla.
2. E hoʻohui i 5 mau puke o Buffer GDP, e hui pono me ka hoʻohuli ʻana a i ʻole ka vortexing.Inā he ʻāpana DNA o ka hoihoi >100 bp, pono e hoʻohui ʻia he 1.5 puke hou (nā laʻana + Buffer GDP) o ka ethanol.
3. E hoʻokomo i ke kolamu i loko o ka paipu hōʻiliʻili, e hoʻololi i ka mixtrue i ke kolamu, centrifuge ma 12,000 rpm (13,800 ×g) no 30 - 60 sec.Inā he >700 µL ka nui o ka hoʻonā hui ʻia, e hoʻihoʻi i ke kolamu adsorption i loko o ka paipu hōʻiliʻili, e hoʻololi i ka hopena i koe i ke kolamu adsorption, a me ka centrifuge ma 12,000 rpm (13,800 × g) no 30 – 60 sec.
4. ʻO ka hana aʻe e pili ana i ka ʻanuʻu 5 - 8 o 08- 1/Gel extraction program.
Nā noi
Nā ʻokoʻa like ʻole o TAE a i ʻole TBE agarose gel;Nā huahana PCR, nā ʻōnaehana hopena enzymatic a i ʻole nā huahana DNA crude ʻē aʻe i loaʻa i nā ʻano hana like ʻole.Loaʻa nā ʻāpana i loaʻa mai70 bp -20 kb.
Nā memo
No ka noiʻi wale nō.ʻAʻole no ka hoʻohana ʻana i nā kaʻina diagnostic.
1. E hoʻohui i 80 ml o ka ethanol e hoʻoheheʻe i ka Buffer GW e like me ka mea i hōʻike ʻia ma ka hōʻailona ma mua o ka hoʻohana ʻana, e mālama i ka lumi wela.
2. Inā maʻalahi ka hoʻoheheʻe ʻana o ka Buffer GDP i ka wā mālama haʻahaʻa haʻahaʻa, hiki ke waiho ʻia ma ka lumi wela no kekahi manawa ma mua o ka hoʻohana ʻana.Inā pono, hiki ke hoʻomaʻamaʻa ʻia i loko o kahi ʻauʻau wai 37 ℃ a hiki i ka hoʻoheheʻe ʻia ʻana o ka precipitate, a laila hiki ke hoʻohana ʻia ma hope o ka hui ʻana.
3. E hoʻonoho i ka mahana ʻauʻau wai i 50 ~ 55 ℃ ma mua.
4. Ma ka 08-1/Gel extraction program step 1, e ho'emi nui ka li'ili'i i ka nui o ka 'āpana gel i ka manawa ho'ohehe'e a ho'onui i ka pono o ka ho'iho'i hou 'ana (Linearized DNA ma'alahi ke hydrolyze ke 'ike mau i ka wela wela).Mai hōʻike i ka gel DNA i UV no ka manawa lōʻihi, no ka mea hiki i ke kukui ultraviolet ke hoʻopōʻino i ka DNA.
5. E hoʻopau loa i ka gel i ka 08- 1/Gel extraction program step 2 a pau, i ʻole e hoʻopilikia nui ʻia ka hana hoʻihoʻi DNA.
6. Preheat Elution Buffer a i ʻole ddH2O i 55 ℃, he mea kōkua ia e hoʻomaikaʻi i ka pono o ka elution DNA.Manaʻo ʻia e mālama i ka DNA i loko o ka eluent o 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5.
