Mea kanu pono PCR Kit
Helu popoki: HCR2020A
ʻO Plant Direct PCR Kit he kūpono ia no ka hoʻonui pololei ʻana i nā lau mea kanu, nā ʻanoʻano, a me nā mea ʻē aʻe, a hiki ke hoʻohana ʻia no ka nānā ʻana i nā laʻana mea kanu i loaʻa ʻole nā polysaccharides a me nā polyphenols.ʻO ka hoʻonui pololei ʻana i ka DNA polymerase e pili ana i ka evolution i kuhikuhi ʻia he ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻomanawanui ʻana i ka PCR inhibitors i nā mea kanu.I kēia manawa, mālama ia i ka hana hoʻonui kiʻekiʻe, kahi kūpono no ka hoʻonui ʻana i nā ʻāpana DNA i loko o 5 kb.Hiki ke hoʻohana ʻia ka Lysis buffer A i loko o ka kit e lyse i nā ʻiʻo mea kanu hou a i ʻole ka hau.He maʻalahi ka hana a hiki ke hoʻohana ʻia ka lysate ma ke ʻano he hoʻohālike no ka hoʻonui ʻana me ka hoʻomaʻemaʻe ʻole.Aia i loko o ka ʻōnaehana nā mea pale e hiki ai ke hoʻonui maikaʻi ʻia nā laʻana ma hope o ka maloʻo a me ka hoʻoheheʻe pinepine ʻana.2 × Pono ʻo Plant Direct Master Mix e hoʻohui i nā primers a me nā mamana no ka hoʻokō ʻana i ka hoʻonui ʻana, a laila e hōʻemi ana i nā hana pipetting a hoʻomaikaʻi i ka ʻike ʻana a me ka hana hou ʻana o nā hopena.
Nā ʻāpana
| Nā ʻāpana | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Mea Hoʻohui Kūlohelohe Kumu | 1.25 ml | 4×1.25 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer A | 5 ml | 20 ml |
| Mea Hoʻopaʻa Lysis Pono B* | 5 ml | 20 ml |
* ʻO Plant Direct Lysis Buffer B kahi mea hoʻoponopono koho, i hoʻohana ʻia e hoʻokaʻawale i ka Plant Direct Lysis Buffer A no ka hoʻolōʻihi ʻana i ka manawa mālama o nā laʻana.Hiki ke hoʻohana ʻia e like me ke kūlana maoli.
Nā Kūlana Waihona
2 × Plant Direct Master Mix, hale kūʻai ma -30 ~ -15 ℃ a pale i ka maloʻo a me ka hoʻoheheʻe ʻana;ʻO Plant Direct Lysis Buffer, mālama ma -30 ~ -15 ℃ a i ʻole 2 ~ 8 ℃.
Kaʻina hoʻokolohua
Laʻana Hana–Lau kanu
Ala pololei:Manaʻo ʻia e hoʻohana i nā lau ʻōpio.E hoʻohana i kahi punch hole me ke anawaena paʻa o 0.5 - 3 mm no ka loaʻa ʻana o kahi samplea liʻiliʻi a like, a laila hoʻohui pololei i ka hāpana i ka ʻōnaehana PCR (manaʻo ʻia ka ʻōnaehana 50 μl).E hoʻomanaʻo, e hōʻoia i ka hāpana PCR a ʻaʻole kūʻē i ka paia paipu.Inā hoʻohana ʻia ka PCR pololei no ka hoʻonui ʻana i nā ʻāpana lōʻihi a me nā laʻana paʻakikī, me ka hoʻohana ʻana i kahi hāpana me ke anawaena liʻiliʻi (0.5 – 1 mm) hiki ke kōkua i ka loaʻa ʻana o nā hopena maikaʻi aʻe.
ʻO ke ala lysis wili:Manaʻo ʻia e hoʻohana i nā lau ʻōpio.E lawe i kahi ʻāpana lau liʻiliʻi (e pili ana i 1 - 3 mm ke anawaena), e waiho i loko o 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, a wili iā ia e like me ka hiki (hiki ke hana ʻia kēia hana ma ke kaomi ʻana i ka lau me ka 100 μl pipette tip. e mash i ka hāpana).Inā hoʻohana ʻia ka nui o nā lau lau (ʻaʻole ma mua o 7 mm), e hoʻonui i ka nui o ka dilution buffer i 50 μl.Ma hope o ka lepo ʻana o nā lau, pono e ʻike ʻia ka ʻōmaʻomaʻo.Ma hope o ka centrifugation pōkole, hoʻohui i 1 μl o ka supernatant i ka ʻōnaehana PCR ma ke ʻano he ʻano hoʻohālikelike.
ʻO ke ʻano lysis thermal:Manaʻo ʻia e hoʻohana i nā lau ʻōpio.E lawe i kahi ʻāpana lau liʻiliʻi (e pili ana i 1 - 3 mm ke anawaena), e waiho i loko o 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, a wela iā 95 ° C no 5 - 10 min.Hiki ke hoʻolōʻihi ʻia ka manawa lysis no nā lau paʻakikī e lyse (ʻaʻole ʻoi aku ma mua o 20 min).Inā hoʻohana ʻia ka nui o nā lau lau (ʻaʻole ma mua o 7 mm), e hoʻonui i ka nui o ka dilution buffer i 50 μl.Ma hope o ka hoʻomehana ʻana, e centrifuge pōkole, a hoʻohui i 1 μl o ka supernatant i ka ʻōnaehana PCR ma ke ʻano he template hoʻohālikelike.
Laʻana Hana– Hua kanu
ʻO ke ala lysis wili:E hoʻohana i ka scalpel e ʻoki i nā hua me ke anawaena o 5 mm, e hoʻohui iā lākou i 100 μl o Plant Direct Lysis Buffer A, a wili i ka laʻana me ka piko pipette a i ʻole nā mea hana ʻē aʻe.Vortex pōkole a kū i ka lumi wela no 3 - 5 min.E hōʻoia i ka hoʻokomo ʻia ʻana o ka mea kanu i loko o ka dilution buffer.Ma hope o ka centrifugation pōkole, hoʻohui i 1 μl o ka supernatant i ka ʻōnaehana PCR ma ke ʻano he ʻano hoʻohālike.
ʻO ke ʻano lysis thermal:E hoʻohana i kahi scalpel e ʻoki i nā hua me ke anawaena o 5 mm, e hoʻohui iā lākou i 100 μl o Plant Direct Lysis Buffer A, a wela ma 95 ° C no 5 - 10 min.Hiki ke hoʻolōʻihi ʻia ka manawa lysis no nā lau paʻakikī e lyse (ʻaʻole ʻoi aku ma mua o 30 min).Ma hope o ka hoʻomehana ʻana, e centrifuge pōkole, a hoʻohui i 1 μl supernatant i ka ʻōnaehana PCR ma ke ʻano he template hoʻohālikelike.
a.Hiki ke hoʻohana ʻia nā ʻoki a i ʻole nā mea hana ʻē aʻe e ʻoki i nā laʻana o ka nui kūpono;inā hoʻohana hou ʻia ka kuʻi a ʻoki paha, pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia me 2% solution sodium hypochlorite ma mua o kēlā me kēia hoʻohana ʻana i mea e pale ai i ka hoʻohaumia ʻana ma waena o nā laʻana.
b.E hōʻoia i ka hoʻoheheʻe ʻia o ka Plant Direct Lysis Buffer ma mua o ka hoʻohana ʻana.Inā ʻeleʻele ka pahu a i ʻole he precipitates, hiki ke hoʻomehana ʻia ma 37 ℃ e hoʻoheheʻe ʻia ma mua o ka hoʻohana ʻana.
c.Hiki ke hoʻololi pono ʻia ka nui o ka template ma ka ʻōnaehana pane e like me ka ʻokoʻa o ka nui o ka mea kanu a me ka diluent i hoʻohui ʻia.
Mea kanu Direct Lysis Buffer
ʻO ka Plant Direct Lysis Buffer A i loko o kēia huahana ua hoʻopaʻa pono ʻia e hoʻokuʻu i ka genome o ka hapa nui o nā ʻiʻo mea kanu a kūpono no ka mālama pōkole o nā mea kanu maʻemaʻe ma 4 ℃.Inā pono e mālama ʻia ka hāpana no ka manawa lōʻihi (e laʻa, 1 – 2 mahina), pono e hoʻololi i ka supernatant i kahi paipu EP hou a mālama iā ia ma -20 ℃.No ka mālama pono ʻana i nā laʻana, e hoʻohui i ka nui like o Plant Direct Lysis Buffer B i ka supernatant i hoʻoili ʻia, hui maikaʻi a mālama i -20 ℃.ʻOkoʻa ka manawa mālama paʻa me nā mea kanu a me nā mokuʻāina.
Pūnaehana Manaʻo
| ddH2O | I ka 20.0 µl | I ka 50.0 µl |
| 2 × Mea Hoʻohui Kūʻokoʻa Kumua | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Kumuhana 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Kumuhana 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Laʻana lau/ʻoʻoleʻa(Nānā i ka Laʻana Hana Hana) | 0.5 – 3 mm lau disc/x µl | 0.5 – 3 mm lau disc/x µl |
a.Loaʻa iā Mg2+i ka hopena hope o 2 mM.
b.Manaʻo ʻia e hoʻohana i ka ʻike hope loa o 0.4μM no kēlā me kēia primer.ʻO ka hoʻohana nui ʻana i nā primers e alakaʻi i ka hoʻonui ʻana i ka hoʻonui ʻole.
c.Hiki ke hoʻololi ʻia ka nui o ka laʻana e like me ke kūlana maoli.Hiki ke hoʻololi ʻia ka nui i hoʻohana ʻia i hoʻokahi hopena o ka hāpana lysed crude ma waena o 2% - 20% o ka nui o ka hopena.ʻO ka hoʻohana ʻana i ka nui o nā laʻana hiki ke hōʻole i ka amplification.
Papahana Hana
| ʻanuʻu | Mahana | Manawa |
| Denaturation mua | 98 ℃ | 5 min |
| Denaturation | 95 ℃ | 10 sec |
| Hoʻopili | 58 ~ 72 ℃ | 15 sec |
| Hoʻonui | 72 ℃ | 30 sec |
| Hoʻonui hope | 72 ℃ | 5 min |
a.Hoʻolaha ka Denaturation mua (98 ℃, 5 min) i ka lysis o ka ʻiʻo mea kanu, e hoʻokuʻu ana i ka DNA genomic hiki ke hoʻohana ʻia no ka PCR amplification.Mai hoʻopōkole i ka manawa a hoʻemi i ka mahana.
b.Manaʻo ʻia e hoʻonohonoho like me ka waiwai Tm kumu a i ʻole 2 ~ 4 ℃ kiʻekiʻe ma mua o ka waiwai Tm.ʻOkoʻa ka DNA polymerase hoʻonui pololei i hoʻohana ʻia i kēia huahana mai ka Taq DNA polymerase maʻamau, a he mau koi kūikawā no ka mahana annealing reaction; hiki i ka hoʻohana ʻana i ka wela annealing kiʻekiʻe ke hōʻemi pono i ka hoʻonui ʻole ʻana a hoʻomaikaʻi i ka pono amplification.No nā mamana paʻakikī, hiki ke hoʻokō ʻia ka hoʻonui ʻana ma o ka hoʻoponopono ʻana i ka mahana annealing a me ka hoʻolōʻihi ʻana i ka manawa hoʻonui.
c.Inā ≤1 kb ka lōʻihi o ka huahana hoʻonui, ua hoʻonohonoho ʻia ka manawa hoʻonui ma 30 sec/kb;inā he>1 kb ka lōʻihi o ka huahana hoʻonui, ua hoʻonohonoho ʻia ka manawa hoʻonui ma 60 sec/kb.
d.No nā laʻana paʻakikī a i ʻole nā laʻana me ka hoʻonui haʻahaʻa haʻahaʻa, hiki ke hoʻonui pono ʻia ka helu o nā pōʻai i 40 -50 pōʻai.
Nā noi
Hoʻohana ʻia ia no ka hoʻonui pololei ʻana i nā ʻiʻo mea kanu a me ka nānā ʻana i nā laʻana mea kanu i loaʻa ʻole nā polysaccharides a me nā polyphenols.
Nā memo
No ka noiʻi wale nō.ʻAʻole no ka hoʻohana ʻana i nā kaʻina diagnostic.
1. No ka hoʻonui ʻana i nā mea kanu maʻemaʻe a i ʻole ka hoʻonui pololei ʻana, pono e hoʻohana i ka DNA genomic i hoʻomaʻemaʻe ʻia ma ke ʻano he mana maikaʻi ma mua o ka hoʻomaka ʻana i ka hoʻokolohua e hōʻoia i ka pololei o ka ʻōnaehana, nā kumu mua a me nā hana.
2. ʻO ka DNA polymerase hoʻonui pololei i hoʻohana ʻia i loko o kēia pahu he hana hōʻoia ikaika.Inā pono e hoʻokō ʻia ka cloning TA, pono e hoʻomaʻemaʻe i ka DNA ma mua o ka hoʻohui ʻana i ka adenine.
3. Alakaʻi hoʻolālā kumu:
a.Manaʻo ʻia ʻo G a i ʻole C ke kumu hope loa ma ka hopena 3' o ke kumu mua.
b.Pono e pale ʻia nā kuhi like ʻole ma nā kumu 8 hope loa ma ka hopena 3′ o ka primer.c.Hōʻalo i ka hoʻolālā lauoho ma ka hopena 3′ o ka primer.
d.ʻAʻole ʻoi aku ka nui o ka waiwai Tm ma mua o 1 ℃ a me ka helu Tm i 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 e helu i ka waiwai Tm).
e.ʻAʻole pono e hoʻokomo ʻia nā kaʻina kumu ʻē aʻe i kūlike ʻole me ke kumu hoʻohālike i ka helu ʻana i ke kumu waiwai Tm.
f.Manaʻo ʻia ʻo ka maʻiʻo GC o ka primer he 40% -60%.
g.ʻO ka puʻunaue holoʻokoʻa o A, G, C a me T i loko o ka primer e like me ka hiki.E hōʻalo i ka hoʻohana ʻana i nā wahi me nā mea GC kiʻekiʻe a i ʻole AT.
h.Hōʻalo i ka loaʻa ʻana o nā kaʻina hoʻohui o 5 a ʻoi aʻe paha nā kumu i loko o ke kumu mua a i ʻole ma waena o ʻelua mau kumu mua a pale i ka loaʻa ʻana o nā kaʻina hoʻohui o nā kumu 3 a ʻoi aku paha ma ka hopena 3′ o nā kumu mua ʻelua.
i.E hoʻohana i ka hana NCBI BLAST e nānā i ka kikoʻī o ka primer e pale ai i ka hoʻonui ʻole.
